"In vitro" assays of mice uNK cells in medium supplemented with chorionic gonadotropin and estrogenic hormones

Orientador: Aureo Tatsumi YamadaDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: O hormônio gonadotrofina coriônica (CG) é sintetizado e secretado pelos trofoblastos logo após a implantação intersticial do embrião no endométrio tanto de humanos quanto de roedores atuando na atividade das células luteínicas ovarianas, assim como no útero assegurando a gravidez bem sucedida. Ao lado do CG, os hormônios esteróides estradiol (E) e progesterona (P) são essenciais no estabelecimento e desenvolvimento da gestação, atuando sobre diferentes tipos celulares. Presume-se que nas células Natural Killer uterinas (uNK) estes hormônios regulam direta ou indiretamente o recrutamento, proliferação, diferenciação e diversas função dessas células. No presente trabalho, inicialmente avaliamos e confirmamos a expressão do receptor do hormônio gonadogrofina coriônica (CGR) nas células uNK de camundongos por meio da imunocitoquímica. Em seguida foram avaliadas a viabilidade das células uNK isoladas do útero de camundongos no 9ºdg e cultivadas em meios suplementadas com CG, P e E. Os sobrenadantes e células destas culturas foram coletadas e analisadas quantitativamente para as concentrações de VEGF (vascular endotelial factor), TNF-alfa, IFN-y, IL-10, granzima B. Da mesma forma, os sobrenadantes e/ou células foram coletadas de celulas uNK em cultivo com meio suplementado com os hormônios foram desafiadas na presença de LPS (lipopolissacarídio) ou, do líquido amniótico ou, em co-cultivo com células embrionárias (E14Tg2A), para analise quantitativa das concentrações de VEGF, TNF-alfa, IFN-y, IL-10 e Granzima B. Nossos resultados demonstraram que as células uNK de camundongos expressam o receptor LH/CGR e são responsivas ao hormônio CG isoladamente e em combinação com P e E, in vitro. Sob a influência de CG e P, as células uNK perduram por mais tempo promovendo sua diferenciação in vitro, porém são reguladas negativamente quanto à biossíntese e secreção de mediadores citotóxico/citolíticos como o TNF-alfa e a granzima B, assim como, do fator angiogênico VEGF. Por outro lado, as células uNK em meio suplementado pelo CG+E+P e desafiadas com LPS, líquido amniótico e células E14Tg2A aumentam a produção da proteína lítica granzima B, relacionada com as via citotóxica da resposta imune inata, sem contudo afetar a expressão de TNF-alfa e VEGFAbstract: Chorionic gonadotrophin hormone (CG) is synthetized and secreted by trophoblast after embryo implantation into the endometrium both in human and rodents and regulate the activities of ovarian lutheinic cells, as well as, modulate the uterine activities to support the healthy pregnancy. The CG and steroid hormones estradiol (E) and progesterone (P) are all together active players affecting several cell types in the maternal-fetal interface of pregnant uterus and therefore considered essential for successful pregnancy. It is presumed these hormones regulate direct or indirectly the recruitment, proliferation, differentiation and many functions of uterine natural killer (uNK) cells. Afterward were evaluated the viability of uNK cells isolated from mouse pregnant uterus at 9th gestational day and cultured in medium supplemented with CG, E and P. Supernatant and cells of these uNK cells culture with hormones were collected after 24h and performed the quantitative analysis of VEGF (vascular endothelial factor), TNF-alpha, IFN-y, IL-10 and Granzyme B. In the same way, uNK cells in culture were challenged with LPS (lipopolysaccharides), amniotic fluid or co-cultured with mouse embryonic cell (E14Tg2A) and these supernatant and/or cells collected for quantitative analysis of VEGF TNF-alpha, IFN-y, IL-10 and Granzyme B. Our results show that mouse uNK cells express CG receptor (LH/CGR) and are sensitive to CG or its combination with P and E. The uNK cells under CG and P stimuli endure for longer time and differentiate in culture, yet their synthesis and secretion of citolitic/cytotoxic mediator TNF-alpha and granzyme B, as well as VEGF expression are downregulated. On the other hand, uNK cells in medium supplemented with CG + E + P and challenged with LPS, amniotic fluid and E14Tg2A cells increase the production of granzyme B lytic protein, related to the cytotoxic pathway of the innate immune response, without however affecting expression of TNF-alpha and VEGFMestradoBiologia CelularMestra em Biologia Celular e Estrutura